#酶聯免疫吸附試驗（ELISA）實驗#
酶聯免疫吸附試驗（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一種對目的分子（如肽、蛋白、抗原、抗體和小分子等）定性或定量的檢測方法，也是目前應用最廣泛的免疫學檢測技術之一。鑒于其強大的特異性和便捷性，ELISA通常被視為生物樣品定量檢測的金標準。
它基于一種酶標記抗體，能夠檢測固定在96孔或384孔酶標板上的抗原，加入的底物可以產生與原始樣品中存在的抗原量相關的顏色變化或光信號。這是一種簡單而快速的技術，用于檢測附著在固體表面的抗體或抗原。作為最敏感的免疫分析方法之一，ELISA在實驗室研究、疾病生物標志物診斷和各個行業的質量控制方面具有商業價值。
ELISA操作方便、特異性強、數據分析簡單、既可定性也可定量，結果明確易于解釋。酶標板（ELISA Plate）是酶聯免疫吸附實驗（ELISA）中不可或缺的工具。
ELISA作為研究工具
許多研究領域都會用到ELISA技術，其可以幫助研究人員了解細胞和組織中蛋白質的表達和調控，如磷酸化特異性和總蛋白評估、分泌蛋白表達、翻譯后修飾評估、免疫學研究、神經學研究、癌癥研究等。
ELISA在藥物的研發與監測中也發揮著重要作用，可用于篩選化合物庫，以確定其與特定蛋白質的結合能力，從而識別潛在的候選藥物以供進一步開發。同時，ELISA可用于監測血液或尿液中的藥物或其代謝物的水平，以確保藥物處于治療水平且無毒性。
ELISA作為診斷工具
除了用于科學研究之外，ELISA還廣泛用于診斷檢測，包括對病毒感染、過敏測試、毒性和癌癥的診斷檢測，是一種快速便捷的臨床檢測手段，這種檢測在擴展后可同時檢測多份樣品。
酶標板怎么選
酶標板的主要材質是聚苯乙烯（PS），通過疏水鍵、離子鍵或共價結合等方式，將抗原、抗體等生物分子吸附到板孔內表面。
根據實驗的需求選擇合適的酶標板，是實驗成功的第一步。
NEST酶標板經表面處理后蛋白結合能力大大増強，可達300－400ng IgG/cm2，主要結合的蛋白分子量>10kD，使用該類酶標板可提高敏感性，并可相對減少包被蛋白的濃度和用量。
Part.01
不同顏色
選擇合適的酶標板顏色取決于實驗的具體需求和條件。目前NEST有透明、白色及黑色三款酶標板可供選擇。
? 透明酶標板：
適用場景：主要用于光吸收檢測，如細胞培養和常規比色分析。
注意事項：不適合發光檢測，因為光會向各個方向發散，影響檢測結果。
? 白色酶標板：
適用場景：高反光性，適合化學發光和底物顯色檢測，靈敏度高。
注意事項：適用于較弱的光檢測，如一般的化學發光和底物顯色。
? 黑色酶標板：
適用場景：光吸收特性強，適合熒光檢測，有效消除背景干擾。
注意事項：適用于檢測較強的光，如熒光檢測；也可以減少非特異反應的影響。
Part.02
可拆卸&不可拆卸
? 不可拆酶標板：板條與板架連為一體；
? 可拆酶標板：板條與板架分離，單孔可拆，靈活性高，尤其適合樣本量不固定的實驗，避免不必要的浪費。
拆裝動作
當需要將板條拆下時，可從板條正面兩端輕輕向上掰動，然后摳取下來，如上圖所示。
若板條太緊難以掰動，可用手指抵住板條底部輕輕向上頂，然后如上圖將板條摳取下來。
務必要戴好無塵手套，以免污染板條而影響板條的透光性。
不可從板條的一端強行掰取，容易造成板條斷裂。
在裝板條時，要注意方向，板條兩端分別設計成方形和半圓形，半圓形那端必須裝在有凸起臺階的卡槽內（箭頭所在處），切勿裝反。
將板條裝入板框后，在兩側和中間部位都需要進行按壓，壓實后方可進行后續實驗。
ELISA常見Q&A
Q1
包被過程有哪些注意事項？
? 包被抗原或抗體的濃度要合適，需通過預實驗進行優化。一般來說，濃度過低會導致信號較弱，過高則可能引起非特異性結合增加。
? 包被的溫度和時間要嚴格控制，通常在 4℃過夜或 37℃孵育 1 - 2 小時。
? 包被液的 pH 值也會影響包被效果，不同的抗原或抗體可能需要不同的 pH 值環境。
Q2
洗滌步驟為什么很重要？
洗滌的目的是去除未結合的抗原、抗體及其他雜質，減少非特異性信號。如果洗滌不充分，殘留的雜質會與酶標抗體結合，導致背景值升高，影響實驗結果的準確性。在洗滌過程中，要注意洗滌液的用量、洗滌次數及每次洗滌的時間，一般需洗滌 3 - 5 次。
Q3
如何避免加樣誤差
使用高精度的移液器，并定期進行校準。在加樣前，要將樣本和試劑充分混勻，但要避免產生氣泡。加樣時，緩慢釋放液體，確保加樣量準確。同時，要注意避免交叉污染，每加完一個樣本或試劑，都要更換吸頭。
Q4
如何判斷 ELISA 實驗結果的有效性？
若使用病毒、質粒或其他載體用于細胞或動物的轉染/感染來研究基因/蛋白的功能影響時，載體攜帶了熒光蛋白，則二抗熒光選擇時或載體熒光蛋白選擇時，熒光蛋白和二抗攜帶熒光素的激發波長和發射波長應互相不能干擾，防止影響正確的熒光結果的觀察
Q5
免疫熒光信號較弱
? 看陰性對照和陽性對照是否符合預期。
陰性對照的吸光度值應低于設定的閾值，陽性對照的吸光度值應在規定的范圍內，且陽性對照與陰性對照之間有明顯的差異。
提高靶標蛋白的表達量.
? 看標準曲線的線性關系
相關系數（R2）應大于 0.99，說明標準曲線擬合良好。
? 看樣本的吸光度值
應在標準曲線的范圍內，否則需要對樣本進行稀釋后重新檢測。
Q6
實驗結果出現高背景的原因有哪些？
? 可能是包被抗原或抗體的濃度過高，導致非特異性結合增加
? 封閉不充分，固相載體上還有未被封閉的位點與酶標抗體結合
? 洗滌不徹底，殘留的雜質與酶標抗體發生非特異性反應
? 酶標抗體的濃度過高或孵育時間過長
? 底物溶液保存不當，發生了非特異性顯色等
Q7
如何進行 ELISA 實驗的質量控制？
? 在實驗前，要對試劑和儀器進行質量檢查，確保其性能良好。
? 實驗過程中，要嚴格按照標準操作規程進行操作，設置陰性對照、陽性對照和標準品，以監控實驗的準確性和重復性。
? 定期對實驗結果進行回顧性分析，總結經驗教訓，及時發現和解決問題。
? 參加室間質量評價或與其他實驗室進行比對也是質量控制的重要手段。
Q7
如果實驗結果出現異常，應該如何處理？
? 仔細檢查實驗操作過程，看是否有失誤，如加樣錯誤、孵育時間或溫度不正確、洗滌不充分等。
? 如果操作沒有問題，可重新檢測樣本，同時更換試劑，以排除試劑的問題。
? 如果結果仍然異常，要考慮樣本本身的因素，如樣本保存不當、樣本中存在干擾物質等。
? 必要時，可采用其他檢測方法對樣本進行驗證，以確定實驗結果的可靠性。
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